3 酵素動力學

動力學可以公式說明酵素對基質分子的催化行為。

3.1 酵素催化反應：. 酵素提供基質一個穩定的空間，有利於穩定其過渡狀態，並快速轉變成為生成物。

　 　 　 生物化學基礎BiochemistryBasics2008 酵素Enzyme(3,4) 細胞與分子 -胺基酸 -蛋白質 -核酸 酵素 -生物技術 回首頁 ■ 講義下載 　 　 　 　 1  酵素的命名 2  酵素的構成 3  酵素動力學 4  酵素的抑制 5  酵素催化機制 6  酵素活性調節 7  細胞代謝調控 8  生物技術應用 3  酵素動力學 3.1  酵素催化反應 3.2  酵素動力學 3.2.1  基本概念 3.2.2  Michaelis-Menten公式推演 3.2.3  Michaelis-Menten公式意義 3.2.4  Vmax及Km的測定與意義 3.2.4.1 Vmax及 Km測定法 3.2.4.2  Km的意義 3.2.4.3 Vmax 的意義 3.2.4.4 酵素活性定義 3.3 雙基質反應 4  酵素的抑制 4.1  酵素的抑制方式 4.2   不可逆的抑制 問題集  (3,4) 　 酵素的作用像分子機器  Wikipedia   Enzyme Transitionstate Enzymeassay Kinetics Michaelis-Menten Enzymeinhibitor HIVprotease 　 　 　 　 ■ 酵素3,4 ■ 相關投影片 3  酵素動力學： 動力學可以公式說明酵素對基質分子的催化行為。

3.1 酵素催化反應： 酵素提供基質一個穩定的空間，有利於穩定其過渡狀態，並快速轉變成為生成物。

 a.反應物(A,B)轉變成生成物(A-B)途中，有過渡狀態[A...B]生成： A+B→[A...B]→A-B  b.過渡狀態(transitionstate)的位能較高，其生成需要耗費能量，稱為活化能(activation energy,Eact)；經由酵素的催化，可降低反應活化能，使反應速率加快，但不影響反應的平衡方向。

 c.一些過渡狀態的類似物(analog) 會佔住酵素活性區，但無法完成反應，即成為抑制劑。

若把這種過渡狀態的類似物做為抗原，免疫動物後所產生的抗體，可能有類似酵素的催化作用，但催化速率很低，稱為 abzyme(catalyticantibody)。

 d.酵素降低活化能的機制有以下幾點，都是因於活性區的特殊立體構造所致： (1)酵素活性區專一性地與基質結合，提供最適的空間排列，以便穩定過渡狀態。

(2)活性區通常為一凹陷口袋，隔開外界的水環境，減低水分子的干擾。

(3)活性區附近的某些胺基酸可提供活性官能基(通常帶有電荷)直接參與反應。

(4)很多酵素含有輔脢或輔因子，輔助反應 (見2.2)。

◆圖1 的酵素動力學大綱以流程圖方式，列出酵素動力學的主要探討項目；當研讀動力學部分時，請隨時依章節號碼參閱本圖。

(圖中酵素的漫畫造型取自 Gonick,L.&Wheelis,M.所著 TheCartoonGuidetoGenetics,有中譯版)  圖 1 酵素動力學公式的推演及其應用 　 投影片 E3a E3-1　　　 E3-2　 E3-3　　 E3-4　 E3-5 ↓ E3-9　　 E3-10 ↓ E3-14　　　　　　　　　　　　　　 E3-21　　　　　　　　　　　　　　　　　　 E3-26 3.2 酵素動力學： 動力學是如何進行的？先改變基質濃度，再看酵素的活性如何變化。

3.2.1基本概念： 酵素動力學的形成，是根基於『過渡狀態濃度恆定』的基本概念。

早在1913年，Michaelis 及 Menten就以轉化脢(invertase) 系統為研究對象，發現有關酵素與基質反應的一些行為模式，他們提出：  a.Steadystate理論： 酵素催化時，基質先與酵素結合，生成過渡狀態，再轉變成產物。

而酵素與基質的結合是可逆的 (E+S→ES)；而當反應達穩定狀態(steadystate)時，其中的[ES]濃度不變(因為ES 生成量等於其消失量)。

 b.酵素行為的數學描述： 反應速率(v)與酵素或基質的關係，可以數學式表示；在固定的酵素量下，反應速率v與基質濃度[S]成雙曲線關係(但只有一股)，可用公式表之，即 Michaelis-Menten(M-M)動力學公式。

3.2.2Michaelis-Menten公式的推演： 由四個基本設定開始，可一步一步推得M-M動力學公式。

 a.酵素E與基質 S反應如下，各步驟反應速率由常數k1, k2,k3 表示：  b.導M-M公式前的四個基本關係及假設： (1)因[ES]不變，故ES 的消耗量等於生成量：k2 [ES]+k3 [ES]=k1 [E][S]                                      (I) (2)總酵素濃度[Et] ＝單獨存在者[Ef]+酵素基質複合體[ES]                                                            (II) (3)反應初速(vo) 是由後半分解反應(k3) 所決定：vo=k3 [ES]                                                           (III) (4)最大反應速率(Vmax) 是假設所有酵素均轉變成[ES]，故上式可改寫為︰Vmax=k3 [Et]            (IV) c.基於上述條件，可推M-M公式如下： 投影片 E3b E3-15 　 E3-16 E3-17 E3-18 　 　 　 E3-19 E3-20 　 　 　 E3-21 E3-22 E3-22 　 　 　 　 　 　 　 E3-23 　 　 　 E3-26 3.2.3Michaelis-Menten公式的意義： M-M公式可以求得 Vmax 及Km，求得 Vmax 及Km有何意義？  a.M-M公式是雙曲線公式。

若固定酵素量，改變其基質量 [S]，則可得到不同的反應初速 vo，再以[S]為x 軸，vo 為y軸作圖，可得到一股雙曲線，其漸近點為 Vmax。

 b.低濃度[S]時反應速率vo與[S]成正比，即 vo～[S] 1，是為一級反應(firstorderreaction)；當[S]增大，vo 接近漸近線時，vo 的改變很小，不受[S]變化的影響，即 vo～[S] 0，稱為零級反應(zeroorder)。

 c.若基質量[S]也固定，則M-M公式變為： 由(IV) Vmax =k3[Et]，故 vo～[Et]，即反應速率與酵素量成正比。

 d.事實上ES→E+P 的反應為可逆，但此逆反應可忽略，因M-M公式的測定，是反應初期所測的反應初速(vo)，此時生成物 [P]的濃度很低，逆反應幾乎無從發生。

◆練習以紙筆自行推演M-M公式及上述各種情況下的變化。

3.2.4Vmax及 Km 的測定與意義： Vmax 及Km 是每一個酵素極重要的性質指標，可以顯示其催化特性。

3.2.4.1 Vmax 及Km測定法： 步驟相當單純，但隨著各種酵素活性測定方法的難易有別。

動力學實驗的基本資料，為在一系列[S]濃度下所測得的反應初速(vo)，依法作圖即可求出 Vmax 及Km。

有以下數種作圖求法：  a.直接作圖法：是最基本的數據作圖。

以 [S]為橫軸vo 為縱軸，所得漸近線的最高處為Vmax， 而Km 則是內插計算50%Vmax 時的[S]值。

 b. Lineweaver-Burk雙倒數作圖法：是最常用的作圖方式。

因直接作圖法只能以漸近估計求得 Vmax，若 x及y軸分別改為1/[S]及1/vo，則可作出一條直線來，由 x軸上的交點求出1/Km，由y軸交點求出1/Vmax。

◆循一實例練習畫出動力學測定的直接作圖及其雙倒數作圖。

並請注意 Vmax 及Km的單位是什麼，為何會得到此種單位？  c. Eadie-Hofstee作圖法：雙倒數圖的直線，在接近y軸處，打點太密，求得直線稍有困難。

若分別以 vo/[S] 及vo 為x,y軸，亦可畫出直線，且各點的分佈較平均。

◆ TheUseoftheEadie-HofsteePlotforDeterminingKineticParameters 3.2.4.2Km 的意義： Km是酵素與基質間親和力的指標，Km 越大親和力越小。

 a.當反應速率為50% Vmax 時，vo =½Vmax，代入 M-M公式，則得： 因此Km 的意義表示，要達到一半最高催化速率時[S]所需濃度。

 b.若某酵素的Km 越低，則表示它要接近Vmax 所需的基質濃度越低。

若一酵素有數種基質，各有不同的Km，則Km 越低的基質，表示它與酵素的親和力越大，催化反應愈容易進行。

Km與[S]一樣是濃度單位(mM 或mM)。

 c.酵素的Km 值可看成在一般細胞內，該酵素基質的大約濃度。

3.2.4.3 Vmax 的意義： 請確實瞭解 Vmax =k3[Et]的意義(公式IV)。

 a. 在足夠的基質濃度下，一定量的酵素所能催化的最高反應速率，即為其 Vmax；要讓一個酵素達致其 Vmax，就要把基質量調至最高濃度。

在比較不同酵素的 Vmax 活性時，要以同樣莫耳數的酵素分子為基準。

 b.單位時間內每莫耳酵素所能催化的基質數(莫耳數)，稱為turn overnumber(t.o.n.)或molecularactivity，一般酵素約在0.1~10,000間 (每秒)，速率快慢相差很大。

當基質量極大於Km時([S]>>Km)，反應推向右邊，E +S→ES→E+P，則k3成為決定因素，即為turnover number，特標記為kcat。

 c.當基質量遠小於Km時 (Km>>[S]則[Et]=[E]而Km+ [S]=Km)，則可以由M-M公式導得：   反應速率成為secondorder，由[E]及[S] 兩項因素決定之。

而kcat/Km 常數的大小則為重要指標，同時顯示酵素的催化效率及專一性。

 d.瞭解上述的Km與 Vmax 後，回顧最早的酵素與基質反應式： 若把此式分成兩半，前半是E+S→ES由k1 與k2主導；後半ES→E+P由k3主導。

顯然 Vmax 是由後半反應決定(記得Vmax =k3[Et])，而Km 則大體上由前半反應所定。

因此，整個酵素反應，是由這兩半反應所共同組成：前半以Km 來決定酵素與基質的親和度，後半以生成物的產生來決定最高反應速率。

注意Km的定義是(k2 +k3)÷k1，故後半反應還是對 Km有些影響。

3.2.4.4酵素活性定義： 有兩種表示酵素活性的方式，請注意其定義不同，不要混淆。

 a.活性單位：酵素活性的表示方法通常使用活性單位 (unit)；即酵素每分鐘若催化1mmole 基質的活性，即定義為1單位活性；注意同一種酵素可能會有不同定義方式的活性單位。

 b.比活性：每單位重量蛋白質 (mg)中所含的酵素活性(unit)，稱為比活性(specificactivity, unit/mg)；因酵素為活性分子，有時會失去活性，雖然蛋白質仍在，但比活性會下降。

　 　 E3-27 　 　 E3-24 　 　 　 　 　 E3-25 　 　 　 E3-28 　 　 　 　 　 　 E3-29 E3-30 　 　 　 E3-31 　 　 　 　 　 E3-32 E3-33 3.3 雙基質反應：  a.上述S→P催化反應，只有一種基質及一種生成物，稱為 Uni-Uni反應。

但事實上大多數酵素反應，有一個以上的基質，也可能有數個生成物，為多基質反應。

例如： S1＋S2   → P (Bi-Uni,雙-單) S → P1＋P2 (Uni-Bi,單-雙) S1＋S2 → P1＋P2 (Bi-Bi,雙-雙)  b.雙基質反應仍可適用於M-M公式，但兩種基質的Km 要分別測定；測S1的時候，反應中的S2濃度要飽和(使S2成為非主導因子)，反之亦然。

 c.Bi-Bi反應中基質(S1,S2)及生成物(P1, P2)的進出次序有數種情形： (1) Random：基質進入活性區並沒有一定次序，但兩個基質都要結合到酵素後，才會開始進行反應。

(2)Ordered sequential：基質依固定次序進入，然後生成物再依序出來。

(3)Orderedping-pong：依 [S1進,P1出;S2進,P2出]次序，像是兩個Uni-Uni組成的；也像是打乒乓球一樣地一來一往。

　 　 E3-34 4  酵素的抑制： 酵素活性的抑制，也是一個重要的調控方式。

4.1酵素的抑制方式：  a. 抑制劑與酵素結合而導致抑制作用，這種結合是可逆或不可逆反應。

 b. 很多生理或藥理上的作用，都是源自於抑制劑對酵素的作用，而使酵素的活性降低，或者完全失去活性。

如消炎的磺胺藥，即是一種細菌酵素基質(PABA) 的類似物，可抑制細菌葉酸的合成，因而抑制細菌生長。

 c. 抑制劑與酵素產生非共價性結合，然後可以阻礙基質進入酵素活性區，或者改變酵素構形而使其失活。

 d.抑制酵素的機制，依抑制劑[I]與酵素[E] 的結合方式，可以分成三種：Competitive,non-competitive及uncompetitive(請見圖2 整理)；由抑制劑對酵素動力學曲線所造成的影響，即可得知是何種抑制方式。

 圖 2 三種酵素抑制機制 4.2不可逆的抑制： 不可逆性抑制劑會對酵素活性區上的主要胺基酸進行共價性修飾，因此酵素活性通常被嚴重破壞，便無上述三種動力學抑制方式。

 a.青黴素 (penicillin) 喬裝成基質，可與細菌的一種酵素發生不可逆的結合，此酵素乃細菌細胞壁生合成的重要酵素，細菌無法正常生成細胞壁而死亡。

有點像是分子版的『木馬屠城記』。

 b.重金屬：Hg2+, Pb2+,Cd2+及砷化物等重金屬，非專一性地與[E]或[ES] 結合，取代原來酵素所需的金屬，而使酵素失去活性。

 c.化學修飾劑：某些化合物可以專一性地修飾特定胺基酸，除了可做為專一性抑制劑外，也可用來檢定酵素活性區中，具有催化反應的胺基酸為何者 (表1)。

 d. 蛋白脢及其抑制劑：蛋白脢廣泛存在於細胞，有其專一性抑制劑可控制其生理活性，二者互相抗拮形成調節控制網。

目前極被重視的 HIV蛋白脢及其人工抑制劑，在醫藥研究上有很大的作用及影響。

◆有關蛋白脢的分類，請見 6.1.2一節。

 表1 若干蛋白脢的抑制劑及其作用機制 抑制劑 全  名 作用基團 目標酵素例  PCMB p-chloro-mercuribenzoate Cys -SH  Papain  DIFP diisopropyl-fluorophosphat Ser -OH  Serproteases  TPCK tosyl-L-phenylalanine chloromethylketone Ser -OH  chymotrypsin  TLCK tosyl-L-lysine chloromethylketone Ser -OH  Trypsin ◆ AProteaseandProteaseInhibitorWebServer (法國Tours 大學的蛋白脢網站)　 投影片 E4 E4-1 E4-2 E4-3 　 　 E4-6 　 E4-7 　 E4-8 　 　 E4-4 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 E4-5 　 　 　 　 　 　 　 　 E4-8 　 　 　 E4-17 ↓ E4-20 　 　 E4-21 　 　 E4-9 E4-10 E4-11 ↓ E4-16 　 E6-14 　 　 E4-22 問題集   以下題目不一定有標準答案，甚至會引起很大的爭議，但這就是問題集之目的。

 1. Hemoglobin並非酵素，但為何也會有部份裂解雙氧水H2O2的作用？  2.請寫出Michaelis-Menten公式，並說明其意義。

 3.說明為何 k3 就是turnovernumber？  4.檢討一個酵素的催化活性，採用 kcat/Km 有何好處？  5.請判斷下列各題的真偽：(並說明原因)  a) 酵素分子中的胺基酸，可直接參與催化反應的，都是一些極性不太強的胺基酸。

 b) 酵素的活性區多為一凹陷口袋，是因為要隔離影響催化反應的干擾因子。

 c)以誘生抗體所製備得的abzyme，可催化所指定的反應，其效率更優於傳統酵素。

 d)為何酵素的反應速率要看k3？ (vo=k3[ES])是因為k1 太大、而k2太小。

 e)Steadystate 理論是說，酵素在一定時間內會達到一平衡穩定的反應速率。

 f)Vmax 大，表示此酵素與基質的親和力越大。

 g)Km 的單位=濃度/時間。

 h)分析酵素活性時，基質濃度不能太高 (差不多是Km的程度即可)，以免干擾反應。

 i)k3 =kcat=turnovernumber  j)Km 可看成[ES]的生成速率常數。

 6.是非選擇題 (答案寫在□內，是→○、非→╳)  a)有關Km 的敘述何者為真？□ Km的單位是mM/sec □ Km=k2÷ (k1+k3) □ Km越大表示對基質結合力強 □ Km隨著酵素的濃度變化而變 □ Km與ES的生成無關  b)有關kcat 的敘述何者為真？□ kcat的單位是sec-1 □ kcat就是k3 □ kcat隨著酵素的濃度變化而變 □ kcat與ES的生成無關  7.酵素動力學可以下式開始：E+S→ES→E+P，請以公式或文字，說明由此式所衍生出來的四個基本觀察。

 8.寫出下列各種酵素抑制劑的作用機制：a)Penicillinb)Sarinc)Sulfadrugd)Heavy metal  9.請判斷下列各題的真偽：(並說明原因)  a) 酵素的抑制劑對人類都有害，在環境或醫藥使用上應完全避免之。

 b)青黴素是一種serine protease的抑制劑。

 c) 磺胺藥是細菌代謝途徑的可逆型競爭性抑制劑，因此只能抑菌不能殺菌。

10.右圖為某酵素的雙倒數動力學作圖，請依指示回答問題：  a)請標示橫座標及縱座標及其單位。

 b)標明圖中a及b點各為何？  c)若有一競爭性抑制劑 X，請在圖中畫出可能的抑制情形。

　 　 　 　 　 ■■■ 本網頁最近修訂日期： 2017/10/31