酵素(5)

酵素的催化機制可以化學反應逐步推得，與分子的構造也有相當大的關係。

5.1 酵素活性區(active site)：. 催化反應都在活性區內進行，活性區可提供有利催化的環境。

　 　 　 生物化學基礎BiochemistryBasics2008 酵素Enzyme(5) 細胞與分子 -胺基酸 -蛋白質 -核酸 酵素 -生物技術 回首頁 ■ 講義下載 　 　 　 　 1  酵素的命名 2  酵素的構成 3  酵素動力學 4  酵素的抑制 5  酵素催化機制 6  酵素活性調節 7  細胞代謝調控 8  生物技術應用 5  酵素的催化機制 5.1 酵素活性區 5.2  協同式催化機制 5.3  順序式催化機制 5.4 酵素的專一性 5.4.1 專一性結合區 5.4.2 專一性結合力量 5.4.3 立體專一性 問題集  (5) Chymotrypsin 的奇妙催化機制  Wikipedia   Enzyme Mechanism Serineprotease Chymotrypsin Proteininteraction 　 　 　 　 ■ 酵素5 ■ 相關投影片 5  酵素動力學： 酵素的催化機制可以化學反應逐步推得，與分子的構造也有相當大的關係。

5.1 酵素活性區(activesite)： 催化反應都在活性區內進行，活性區可提供有利催化的環境。

 a.活性區：是酵素與其基質 (或輔脢)的結合區，並在此進行催化反應。

活性區通常是一凹陷袋狀構造，水分子不易進入袋中。

活性區內的胺基酸，只有那些具反應性基團 (reactivegroup)者，才直接參與催化；但各種胺基酸都有可能參與結合基質。

 b.酵素催化的化學機制，通常是以下面三種基本方式進行反應： (1)Bondstrain：基質結合到酵素後，酵素的構形扭曲，使基質分子內某共價鍵受力斷裂。

(2)Acid-base：利用活性區內胺基酸殘基或輔脢，可以放出或接受質子 (或電子)的特性，對基質進行質子或電子的轉送。

(3)Orientation：活性區可提供基質適當的排列空間，使有利於反應進行。

以上三種方式或可同時發生，為協同式(concertedset)；亦可先後依序發生，稱順序式(sequential mechanism)。

以下兩個重要例子都是蛋白脢。

　 　 投影片 E5   E5-1　　　 E5-2　　　　　　 E5-3　 5.2 協同式催化機制： 以carboxypeptidaseA(CPA,羧肽脢) 為模型酵素說明(圖3)。

 a.CPA的分子量34kD，含307個胺基酸，有一雙硫鍵，及一個鋅離子，是一種金屬蛋白脢。

CPA可由胜肽的C-端，依序切下外側胺基酸 (外切脢)，當胺基酸的R基團為非極性者，較有利反應進行；而carboxypeptidaseB(CPB)只切C-端為Lys 或Arg者，二者專一性不同。

 圖 3 CarboxypeptidaseA的催化機制 ◆ Carboxypeptidase 催化機制 (以動畫呈現上圖之催化動作) b.CPA的詳細催化機制如圖3 所示，並加說明於下：(括號內數字與圖3中對應) (1)Zn2+ 離子乃重要輔助因子，可吸住基質胜肽鍵上的 carbonyl基，增強其極性，使a 碳帶正電。

(3)Glu270吸住水分子，放出OH- 攻擊C+(2)，產生新的C-OH鍵。

(4)Tyr248-OH上的質子，與氮 lonepair電子產生新鍵，原來的胜鍵斷裂。

(5)附近的胺基酸與基質C-端的R 基團，有專一性的結合，以辨別基質的極性；同時Arg145與基質C-端的-COOH結合，確定基質蛋白質是以C-端進入活性區。

　 　 　 　 E5-4 E5-5 5.3 順序式催化機制： 以chymotrypsin(CT, 胰凝乳蛋白脢)為代表，請找出課本的相關圖片。

 a. 分子構造：CT的分子量為25kD，含三條胜肽，由兩個雙硫鍵連接，是轉譯後修飾的產物；剛轉譯出來的完整胜肽鏈沒有活性，要在接近 N-端的Arg15與Ile16之間先斷開後，CT才能活化。

 b. 催化活性：CT可水解胜肽鏈上面的芳香族胺基酸 (Tyr,Phe,Trp)或Met(具較大非極性基團者)，切開這些胺基酸C-側的胜鍵，是一種內切脢。

 c. 活性區：CT大部分的極性胺基酸都露在分子外表，只有三個在活性區內，對催化反應扮重要角色(Ser195,His57, Asp102)。

三者以『電荷接力』形成高反應性Ser，其Ser195-OH基上的H+被鄰近的His57 吸收，生成具有高反應性的-O-。

◆ Chymotrypsin 活性區鐵三角 (以動畫呈現活性區之生成)  圖 4 Ser蛋白脢催化區上由三個胺基酸所構成的電荷接力 d.催化機制：Ser上的高反應性  -O-會攻擊基質胜肽上的 carbonyl碳(帶微正電)，形成新的C-O鍵(acylation步驟)，同時斷開基質的胜鍵，先釋出一段C-側的胜肽；然後加水分解，破壞此 C-O鍵(deacylation步驟)，釋出另一段N-側胜肽。

以上兩個步驟，依次順序發生。

◆ Chymotrypsin 催化機制 (以動畫呈現上述之催化動作)  e.穩定過渡狀態：除了 catalytictriad可以有效催化之外，活性區也可穩定催化反應的中間過渡狀態。

過渡狀態有相當高的負電荷，因此以活性區附近的 Gly193及Ser195本身的-N-H與之產生氫鍵而中和之。

 f.Ser 蛋白脢家族：這種以Ser為催化主力的蛋白脢很多，統稱為serine型蛋白脢；除了chymotrypsin 外，尚有許多如trypsin(胰蛋白脢)、elastase(彈性蛋白脢)。

它們的催化機制相似，整體構形相當類似，且都有 [Ser-His-Asp]接力形式的催化機構。

但對基質的專一性不同，trypsin的基質為鹼性胺基酸(Lys, Arg)，elastase則只切R基團較小且不帶電荷者。

　 　 E5-7 E5-8 　 　 E5-14 E5-15 E5-9 　 E5-11 ↓ E5-13 　 E5-10 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 E5-16 E5-17 　 E5-18 ↓ E5-21 E5-22 　 5.4 酵素的專一性： 酵素只與特定的基質結合，有很高的專一性，這是酵素重要特性之一。

5.4.1專一性結合區： 大部份酵素的活性區即有專一性辨識與結合基質能力，但CT另有一基質的辨識區位在其活性區附近。

 a.上述各Ser 型蛋白脢的活性區除了有[Ser-His-Asp] 催化中心外，附近還有一個袋狀的基質結合區，可以辨別基質的種類(驗明正身)，以便與正確的胺基酸結合。

 b.這種專一性結合是靠結合區上胺基酸R 基團的形狀、大小、極性或電荷等性質的契合，以二級鍵結合。

例如chymotrypsin 的結合區多含非極性的胺基酸，故只能與非極性的芳香族胺基酸結合，催化這類胺基酸的水解。

改變結合區的重要胺基酸，可能改變專一性 (Science,1992,255:1249)。

5.4.2專一性結合力量： 有兩大類構成因素，一是形狀的互補，另一是吸引力量。

(參考 蛋白質2.3)  a.分子間構形互補：如『鎖頭與鑰匙lock& key』在形狀的契合；而蛋白質分子有彈性，與基質結合可誘生更契合的構形，稱為induced fit。

因構形互補而吸引的主要力量來自凡得瓦爾力，如圖5中A與B之間的契合。

 b. 酵素與基質間會產生吸引力量，是由兩者間的若干二級鍵所共同組成。

  圖 5 兩分子間構形互補 5.4.3立體專一性： 酵素分子如何辨認立體異構物？碳的原子軌道是根本原因。

(參考 細胞與分子圖4)  a. 酵素可辨認基質的立體不對稱性，只能對某一種立體異構物有催化反應(如L或 D型胺基酸之一)，而生成物也只有對應的立體異構物之一。

 b.如圖6把基質分子中不對稱碳(sp3) 四個鍵結中的一點(A)固定，再以酵素的專一性結合面(深綠色)接觸並確認B-C-D三點，就能分辨另一異構物的差異(例如B-D-C) 而排斥之(從A點往下看即可分出差異，如圖7)。

 圖 6 碳原子四面體   圖 7 不對稱碳鍵結排列的立體差異 ■■■ 增補幾個酵素催化機制的實例   下載連結：[Enz(5A) 2008.PPT] 　 　 　 　 　 　 　 E5-23 E5-24 E5-25 E5-26 E5-27 E5-28 　 　 　 　 P5-18 　 　 E5-29 C1-9 　 問題集   以下包含酵素部份的全部問題。

題目不一定有標準答案，甚至會引起很大的爭議，但這就是問題集之目的。

 1. CarboxypeptidaseA分子的活性區需要一個Zn離子，請問此金屬離子有何作用？  2. 酵素活性區的構形與下列三者何者較能互補？請說明為何？基質生成物過渡狀態  3.為何維持正確的酸鹼度pH，對某些酵素的活性非常重要？有無酵素不受pH影響？  4.抗體與其抗原極類似酵素及基質，有很強的專一性，但並無酵素的催化作用；而catalyticantibody(或abzyme) 為特別設計產生的抗體，可使抗體具有催化的性質。

若有反應如︰A＋B→A-B，而你要設計能催化此反應的抗體(A與B均為小分子)。

a)你將以何種分子為抗原？詳細說明原因。

(hint:為何酵素具有催化能力？) b)在進行免疫時，應當注意那些事項？  5.為何 chymotrypsinogen分子要先經過裂解後，才會變成活性型？  6.Chymotrypsin如何穩定所催化基質的中間過渡狀態？  7.Chymotrypsin的His57對其催化機制有何貢獻？His57如何受到環境pH的影響？  8.已知DPF(diisopropyl phosphofluoridate)是Serprotease的專一性抑制劑，如何證明DPF是攻擊酵素的活性區？  9.大部份 proteases似乎都有相類似的水解機制，請說明此一核心機制。

10.胜肽鏈上可被 trypsin專一性水解的胺基酸有哪兩種？ 11.請判斷下列各題的真偽：(並說明原因)  a) 水溶性蛋白質的疏水性胺基酸大都在分子的裡面，故酵素分子內部不可有親水性胺基酸，以防止分子變性。

 b) 只要含有二十種基本胺基酸基團，蛋白質就可以完全發揮酵素的催化機制。

 c)CarboxypeptidaseA 是一種外切脢，可切除蛋白質C-端的非極性胺基酸，它可以與a-COOH 結合來辨識是否為C-端。

 d)Serproteases都有由 Asp-His-Ser組成的triad，可產生一具高反應性的-O-基。

 e) 酵素催化反應進行的過程中，酵素與基質或產物之間，都不能有共價鍵生成，這才能稱為催化。

 f) 蛋白脢催化過程中，所形成過渡狀態有過多正電荷，要用氧原子上的電子中和之。

 g) 剛轉譯出來的完整chymotrypsin，其催化活性很低，是因為無法穩定過渡狀態。

 h) 一般酵素的活性區與專一性辨認區都不在同一位置，以便增加專一性。

 i) 兩個蛋白質間的專一性結合，其構形的互補是重要條件之一，乃因於凡得瓦爾力。

 j) 以下配對都是專一性吸引力所造成：酵素-基質、酵素-輔脢、荷爾蒙-受體。

12.是非選擇題 (答案寫在□內，是→○、非→╳)  a)何者為Serprotease家族？□ Subtilisin □ 凝血因子VIII □ Acetylcholinesterase □ Elastase □ Thrombin  b)何者為酵素的不可逆抑制劑？□ Penicillin □ PCMB □ DFP □ EDTA □ 磺胺藥 □ cAMP  c)改變下列那個胺基酸後會影響 chymotrypsin的活性：□ Asp102 □ His57 □ Ser14 □ Ile16 □ C-terminal  d) 可構成兩個分子間的專一性吸引力的力量有那些：□ 氫鍵 □ 疏水鍵 □ 雙硫鍵 □ 凡得瓦爾力 □ 離子鍵 □ 分子間構形互補  e)有關立体專一性何者為真？□ 碳原子的sp3軌道是主因 □ 自然界中多使用L-胺基酸 □ 單糖分子並無立体異構物 □ 酵素可分辨基質立体異構物 13.請簡單解釋以下名詞：Abzyme,Metabolomics,Ribozyme,Proteasome,Specific activity 　 　 　 　 ■■■ 本網頁最近修訂日期： 2017/10/31