液相色譜常見難解問題全解答(含基線漂移、拖尾、分叉峯

HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峯在出峯 ... 評介一根色譜柱的基本指標是：塔板數、峯不對稱因子、柱壓降、適用範圍 ... 人人焦點 影視 健康 歷史 數碼 遊戲 美食 時尚 旅遊 運動 星座 情感 動漫 科學 寵物 家居 文化 教育 故事 液相色譜常見難解問題全解答(含基線漂移、拖尾、分叉峯、保留時間漂移、柱壓過高等) 2021-02-13食品儀器分析 高效液相色譜法按分離機制的不同分爲液固吸附色譜法、液液分配色譜法(正相與反相)、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法，這些方法在使用的過程中往往會遇到諸如鬼峯、基線漂移、拖尾、分叉峯、保留時間漂移、柱壓過高等系列問題，如何解決這些問題呢?1.用HPLC進行分析時保留時間有時發生漂移，有時發生快速變化，原因何在?如何解決? 關於漂移問題： ①溫度控制不好，解決方法是採用恆溫裝置，保持柱溫恆定; ②流動相發生變化，解決辦法是防止流動相發生蒸發、反應等; ③柱子未平衡好，需對柱子進行更長時間的平衡; 關於快速變化問題 ①流速發生變化，解決辦法是重新設定流速，使之保持穩定; ②泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出; ③流動相不合適，解決辦法爲改換流動相或使流動相在控制室內進行適當混合; 2.液相色譜中峯出現拖尾或出現雙峯的原因是什麼? ①篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子; ②存在干擾峯，解決辦法爲使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子; ③可能柱超載，減少進樣量; 3.HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法 ①樣品量不足，解決辦法爲增加樣品量; ②樣品未從柱子中流出。

可根據樣品的化學性質改變流動相或柱子; ③樣品與檢測器不匹配。

根據樣品化學性質調整波長或改換檢測器; ④檢測器衰減太多。

調整衰減即可; ⑤檢測器時間常數太大，解決辦法爲降低時間參數; ⑥檢測器池窗汙染。

解決辦法爲清洗池窗; ⑦檢測池中有氣泡。

解決辦法爲排氣; ⑧記錄儀測壓範圍不當。

調整電壓範圍即可; ⑨流動相流量不合適。

調整流速即可; ⑩檢測器與記錄儀超出校正曲線。

解決辦法爲檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。

 4.做HPLC分析時，柱壓不穩定，原因何在?如何解決? ①泵內有空氣，解決的辦法是清除泵內空氣，對溶劑進行脫氣處理; ②比例閥失效，更換比例閥即可; ③泵密封墊損壞，更換密封墊即可; ④溶劑中的氣泡，解決的辦法是對溶劑脫氣，必要時改變脫氣方法; ⑤系統檢漏，找出漏點，密封即可; ⑥梯度洗脫，這時壓力波動是正常的。

 5.我最近更換了另一種牌號的ODS柱，雖然分離情況仍可以，但保留時間不能重現，爲什麼? 這是因爲被分析物可能具有形成氫鍵的能力，儘管過去幾年來，填料的製造技術有了極大的提高，但不同的廠商的ods填料表面矽醇基的濃度不同。

正是這些矽醇基可能與樣品發生相互作用。

因此，同一被分析物中的各組分在不同牌號的ods柱上的相對保留時間就可能不同。

在流動相中加入少量競爭物，如，三乙基胺(tea)，將會使矽醇基的成鍵能力飽和，從而能保證不同牌號柱子上的相對保留時間具有較好的重現性。

如分離情況可以，系統穩定，達到系統適用性要求，就不必保留時間的重現。

 6.我購買的HPLC柱驗收測試時柱壓過高，請問爲什麼? 柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。

其原因有多方面，而且常常並不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因： ①拆去保護預柱，看柱壓是否還高，否則是保護柱的問題，若柱壓仍高，再檢查; ②把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查; ③將柱子的進出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相衝洗柱子，(此時，不要連接檢測器，以防固體顆粒進入流動池)。

這時，如果柱壓仍不下降，再檢查;只用於使用過的柱子。

 ④更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質，正是這些雜質將篩板堵塞引起壓力上升。

若柱壓還高，請與廠商聯繫。

一般情況下，在進樣器與保護柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題，sge提供的rheodyne7315型過濾器就是解決這一問題的最佳選擇。

 7.色譜雙峯產生的可能及判斷和處理? HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峯在出峯時間較短的條件下(不包括梯度)，峯型應對稱而尖銳。

但是，在對樣品了解程度不夠，方法不妥，樣品處理方法及進樣方式不合理下，會出現各種意想不到的問題，而對色譜峯難以作出合理的解釋，尤其對於新手更是如此。

下面根據本人幾年工作的體會，提出一些看法，向同仁指教。

色譜雙峯指的是明是一種物質，但在色譜圖中出現雙峯，而表明含二種物質。

我將這種情況分爲四種原因。

 ①色譜柱 如果你分析樣品時發現每個色譜峯都雙峯出現(出峯越快，雙峯的可能性會減少)，尤其採用單一純物質時，可以肯定色譜柱出問題-柱頭受損或柱頭固定相變髒或流失。

如果進樣量少，原來色譜柱正常，色譜峯的形狀多爲一大峯帶一小峯，不一定拖尾，這一般應是柱頭受堵，將色譜柱反過來接，用流動相衝洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物衝掉，再反過來，一般情況下就行了。

當然不反衝，正沖有時也會正常的。

如果峯拖尾，雙峯強弱相差不大，柱頭固定相變髒或流失可能性更大，這是可以將進樣那頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術，同時不能老乾那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會應柱效很低而報廢。

 ②溶劑極性及進樣量： 許多HPLC分析者對此可能不以爲然，一般的HPLC的書籍和文獻都不會提到這方面的內容，而這是雙峯產生的一個很重要的原因。

目前，HPLC分析多爲反相色譜，流動相多爲甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。

樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解。

最佳的溶解方法是用流動相溶解，但是很多情況是不一致的。

當用溶劑極性強度大的試劑，如，純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水爲主，樣品進樣量大，如，定量管爲20μL，此條件下完全可以肯定，單一的純物質出雙峯，第二峯比第一峯小(每次都不太一樣)，且拖尾，保留時間會提前(相對進樣量少而言)，將進樣量減少一半以上，峯型將變爲正常。

這是樣品的溶劑與流動相極性相差太大，而流動相來不及將其稀釋達到平衡造成的。

上面提到進樣量造成雙峯的一個原因，另一個原因是，進樣量不一定大，但絕對量很大，色譜圖上的雙峯緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾(如果出峯很快，也可能是色譜柱問題)。

將樣品稀釋再進樣就可以了，這是由於進樣量過大，色譜柱過載造成的。

 ③樣品的特性 有些樣品由於其化學結構的特點，存在互變異構現象，而這種互變異構體無法分開，而是以一個動態平衡存在。

在色譜分析時，在一個特定的條件下，一種物質將出現雙峯，雙峯靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峯現象將消失，如，紅黴素等。

有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峯，但在LC-MS下，用質譜檢測器，其質譜的總離子流圖上較明顯，例如，我分析過的農藥啶蟲眯(吡蟲清)。

 ④參數 記錄的參數一般都內定的，不必修改，但GC和HPLC的參數是不完全一致的，例如，c-r3a數據記錄儀上的一般記錄時間間隔GC爲2MS，HPLC爲5MS，如果記錄間隔時間縮短，一個峯將變爲二個峯或更多。

 8.色譜柱中的流動相會排乾嗎? 不少做色譜分離試驗的人遇到過這樣的情形：不慎未及時補充流動相，泵將溶劑瓶中的流動相吸乾了，HPLC系統由此而停止工作了。

如此情況是否會損壞色譜柱?泵是否已將色譜柱中所有流動相都排乾了?色譜柱還能使用嗎?事實上，如果泵將溶劑瓶中的流動相吸乾，並不會造成色譜柱的損壞。

即使泵中充滿了空氣，泵也不會將空氣排入色譜柱。

因爲泵只能輸送液體，而不能輸送空氣。

 相比之下，另一個更可能發生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。

同樣，整個色譜柱乾涸的情況不太容易發生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個毫米變幹了，因揮發掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當長的時間。

即使色譜柱真的變幹了，也不一定就不可救藥了。

可以嘗試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑(如經氦氣脫氣的甲醇)沖洗色譜柱以除去氣體。

較低的表面張力有助於浸潤填料表面;已脫氣的溶劑應該能夠溶解並去除滯留在填料中的氣體。

色譜柱大約需要(以1mL/min的流速)沖一個小時或更多的時間被徹底浸潤，恢復到正常狀態。

 9.使用peek(polyetheretherketone)管路和接頭需要注意什麼問題? 如果經常需要改變流路或更換不同品牌的色譜柱，使用peek材料製成的管路和接頭會非常方便。

peek管路容易連接;peek接頭不僅無需工具，手擰即可固定，而且容易調節錐箍之外的管路長度，方便與不同品牌或規格的色譜柱相連接。

 使用此類材料的管路需要注意的是：peek對鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。

雖然未觀察到上述溶劑溶解peek材料的明顯跡象，但，peek遇到上述溶劑會變脆。

另一個西藥考慮的因素是壓力限。

不鏽鋼管可耐受6000psi的壓力，但peek管只能耐受近4000psi(但多數hplc應用系統壓力不會超過3000psi)。

 使用peek接頭時則無需擔心接頭耐溶劑性能，因爲接頭幾乎或很少與溶劑直接接觸。

但手擰固定的peek接頭壓力限低於不鏽鋼管，因而壓力太高時，可能會使接頭在管路上滑動而產生死體積或漏液。

 10.液相色譜梯度洗脫中柱溫的影響 許多色譜工作者在操作液相色譜時，色譜柱是在室溫環境下工作的。

如果實驗室的溫度能保持不變的話，不會有什麼大問題。

但大多數的工作環境溫度是不斷變化的，因此若想將在某實驗室開發的一種液相色譜方法應用到其他實驗室的話，溫度的差別就會引起較複雜的問題。

溫度的影響在所有的色譜分析方式中都是存在的，本文就來討論液相色譜方法中的梯度洗脫方式受溫度影響的問題。

 等度保留 大多數色譜工作者知道等度洗脫時溫度會影響保留時間。

擁有溫控系統的實驗室一般都有全天候溫控設置，但這種設置可能引起室溫顯著變化，這對整夜運行的色譜系統就會有一些影響，例如，我們實驗室的夜間溫度就設爲4～7℃。

在不同的季節，實驗室的夜間溫度可能比正常工作日的溫度高或低，這種溫度的變化就會使色譜峯離開「保留時間窗」，造成連續進樣中產生一系列的無效數據。

 還有一個可能的溫度影響因素就是色譜儀器在實驗室的位置。

當色譜柱正對著空調的送風口時，雖然整個實驗室的溫度非常穩定，但色譜系統的溫度就會不斷的變化。

這就是我們要使用柱溫箱的原因之一。

 梯度保留 溫度變化對梯度洗脫和等度洗脫的影響趨勢是一樣的。

若梯度洗脫時不控制溫度的話，保留值一般都會有較大的變化。

 結論 我們發現柱溫在液相色譜梯度洗脫過程中扮演了一個重要的角色，首先，提高柱溫可以縮短保留時間，其次，我們看到柱溫還可以影響選擇性，最後，溫度的不平衡會導致峯扭曲變形。

這些提醒我們，如果想得到穩定可靠的分離結果，色譜柱的溫度變化是不可忽視的。

 11.爲何會基線漂移 原因 ①柱溫波動。

(即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動。

通常影響示差檢測器、電導檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。

) ②流動相不均勻。

(流動相條件變化引起的基線漂移大於溫度導致的漂移。

) ③流通池被汙染或有氣體; ④檢測器出口阻塞。

(高壓造成流通池窗口破裂，產生噪音基線); ⑤流動相配比不當或流速變化; ⑥柱平衡慢，特別是流動相發生變化時; ⑦流動相汙染、變質或由低品質溶劑配成; ⑧樣品中有強保留的物質(高k』值)以饅頭峯樣被洗脫出，從而表現出一個逐步升高的基線。

 ⑨使用循環溶劑，不提倡。

未調整檢測器。

 ⑩檢測器沒有設定在最大吸收波長處。

 解決方法 ①控制好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器; ②使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和添加劑。

流動相在使用前進行脫氣，使用中使用在線脫氣或氦氣脫氣。

 ③用甲醇或其他強極性溶劑沖洗流通池，如有需要，可以用1n的硝酸。

(不要用鹽酸) ④取出阻塞物或更換管子。

參考檢測器手冊更換流通池窗。

 ⑤更改配比或流速。

爲避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速。

 ⑥用中等強度的溶劑進行沖洗，更改流動相時，在分析前用10～20倍體積的新流動相對柱子進行沖洗。

使用離子對試劑、緩衝鹽更應注意平衡柱。

 ⑦檢查流動相的組成。

使用高品質的化學試劑及HPLC級的溶劑 ⑧改變分析條件。

使用保護柱，如有必要，在進樣之間或在分析過程中，定期用強溶劑沖洗柱子。

 ⑨重新設定基線。

使用新的流動相。

 ⑩將波長調整至最大吸收波長處。

重選檢測波長。

 12.規則的基線噪音是如何產生的 原因 ①在流動相、檢測器或泵中有空氣(尖銳峯)。

 ②漏液。

 ③流動相混合不完全。

 ④溫度影響(柱溫過高，檢測器未加熱)。

 ⑤在同一條線上有其他電子設備(偶然噪聲)。

 ⑥泵振動。

 解決方法 ①流動相脫氣。

沖洗系統以除去檢測器或泵中的空氣。

 ②檢查管路接頭是否鬆動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。

如有必要，更換泵密封。

 ③用手搖動使混合均勻或使用低粘度的溶劑。

 ④減少差異或加上熱交換器。

 ⑤斷開lc、檢測器和記錄儀，檢查干擾是否來自於外部，加以更正。

採用精密級穩壓電源。

 ⑥在系統中加入脈衝阻尼器。

 13.不規則的基線噪音是如何產生的 原因 ①漏液 ②流動相汙染、變質或由低質溶劑配成 ③流動相各溶劑不相溶 ④檢測器/記錄儀電子元件的問題 ⑤系統內有氣泡 ⑥檢測器內有氣泡 ⑦流通池汙染(即使是極少的汙染物也會產生噪音。

 ⑧檢測器燈能量不足 ⑨色譜柱填料流失或阻塞 ⑩流動相混合不均勻或混合器工作不正常 解決方法 ①檢查接頭是否鬆動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。

如有必要，更換密封。

檢查流通池是否漏液。

 ②檢查流動相的組成。

 ③選擇互溶的流動相 ④斷開檢測器和記錄儀的電源，檢查並更正。

 ⑤用強極性溶液清洗系統 ⑥清洗檢測器，在檢測器後面安裝背景壓力調節器 ⑦用1n的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池 ⑧更換燈 ⑨更換色譜柱 ⑩維修或更換混合器，在流動相不走梯度時，建議不使用泵的混合裝置 14.保留時間漂移的故障排除 保留時間不重現有兩種不同的情況：既保留時間漂移和保留時間波動。

前者是指保留時間僅沿單方向發生變化，而後者指保留時間無固定規律的波動。

將此兩種情況區分開來對找到問題的原因往往很有幫助。

如，保留時間的漂移往往由柱老化引起;而柱老化不可能引起保留時間的無規律波動。

事實上，保留時間漂移的多半原因是不同機理的色譜柱老化，如固定相流失(例如，通過水解)，色譜柱汙染(由樣品或流動相所致)等。

保留時間漂移的幾種最常見的原因如下： (1)色譜柱平衡 如果我們觀察到保留時間漂移，首先應考慮色譜柱是否已用流動相完全平衡。

通常平衡需要10～20個柱體積的流動相，但如果在流動相中加入少量添加劑(如，離子對試劑)則需要相當長的時間來平衡色譜柱。

 流動相汙染也可能是原因之一。

溶於流動相中的少量汙染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留時間的漂移。

應注意：水是很容易汙染的流動相成分。

 (2)固定相穩定性 固定相的穩定性都是有限的，即使在推薦的pH範圍內使用，固定相也會慢慢水解。

例如，矽膠基質在pH=4時水解穩定性最好。

水解速度與流動相類型和配體有關。

雙官能團配體和三官能團配體比單官能團配體的鍵合相要穩定;長鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩定;烷基鍵合相比氰基鍵合相穩定的多。

 經常清洗色譜柱亦會加速色譜柱固定相的水解。

其他矽膠基質鍵合相在水溶液環境中也可以發生水解，如，氨基鍵合相等。

 (3)色譜柱汙染 保留時間漂移的另一個常見原因是色譜柱汙染。

HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾並吸附流動相攜帶的任何物質。

汙染源可以是：流動相本身，流動相容器，連接管、泵、進樣器和儀器密封墊，以及樣品等。

通常通過實驗可判斷汙染的來源。

 樣品中如果存在色譜柱上保留很強的組分，就可能是使保留時間漂移的潛在根源。

這些根源通常是樣品基質，如，配藥中的賦形劑，生化樣品(如，血清)中的蛋白及類脂類化合物，食品樣品中的澱粉，環境水樣中的腐殖酸等。

通常樣品中的強保留組分具有較高的分子量，在此情況下，保留時間漂移的同時或其後會有反壓的增加。

可以通過使用固相提取(SPE)等樣品前處理方法來去除樣品基質的影響。

 避免色譜柱汙染最簡單的方法是防患於未然。

相比之下，找到問題的所在並設計有效的清洗步驟以去除汙染物要困難的多。

通常使用在給定色譜條件下的強溶劑，但並非所有汙染物都可以在流動相中溶解，如，thf可去除反相色譜柱中的許多汙染物，但蛋白在thf中就不能溶解。

dmso常常用於去除反相色譜柱中的蛋白。

使用保護柱是個非常有效的方法。

反衝色譜柱僅是不得已時採用的辦法。

 (4)流動相組成 流動相組成的緩慢變化也是保留時間漂移的常見原因。

如流動相中易揮發組分的揮發及循環使用流動相等。

 (5)疏水坍塌 當小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水爲流動相時，有時會發生分離突然喪失及被分析物質保留明顯降低或完全不保留的現象，這就是疏水坍塌。

此現象是由流動相不浸潤固定相表面而致。

挽救的辦法實現用含大量有機組分的流動相浸潤固定相，再用高水含量的流動相進行平衡。

色譜柱長期儲存也會發生此現象。

使用內嵌極性基團的反相色譜柱(如，waterssymmetryshieldrp色譜柱)或非端基封口的色譜柱(如，watersresolve色譜柱)也可避免發生坍塌。

 15.爲何出現肩峯或分叉? ①樣品體積過大--用流動相配樣,總的樣品體積小於第一峯的15%; ②樣品溶劑過強--採用較弱的樣品溶劑; ③柱塌陷或形成短路通道--更換色譜柱,採用較弱腐蝕性條件; ④柱內燒結不鏽鋼失效--更換燒結不鏽鋼,加在線過濾器，過濾樣品; ⑤進樣器損壞--更換進樣器轉子 16.爲何出現鬼峯? ①進樣閥殘餘峯--每次用後用強溶劑清洗閥，改進閥和樣品的清洗; ②樣品中未知物--處理樣品; ③柱未平衡--重新平衡柱,用流動相作樣品溶劑(尤其是離子對色譜); ④三氟乙酸(tfa)氧化--每天新配，用抗氧化劑; ⑤水汙染(反相)--通過變化平衡時間檢查水質量，用HPLC級的水; 17.爲何出現峯拖尾? ①柱超載--降低樣品量,增加柱直徑採用較高容量的固定相; ②峯干擾--清潔樣品，調整流動相; ③矽羥基作用--加三乙胺，用鹼致鈍化柱，增加緩衝液或鹽的濃度降低流動相pH值，純化樣品; ④柱內燒結不鏽鋼失效--更換燒結不鏽鋼，加在線過濾器，過濾樣品; ⑤柱塌陷或形成短路通道--更換色譜柱，採用較弱腐蝕性條件; ⑥死體積或柱外體積過大--連接點降至最低，對所有連接點作合適調整，儘可能採用細內徑的連接管; ⑦柱效下降--用較低腐蝕條件，更換柱，採用保護柱; 18.爲何出現峯展寬? ①樣品體積過大--用流動相配樣，總的樣品體積小於第一峯的15%; ②在進樣閥中造成峯擴展--進樣前後排出氣泡以降低擴散; ③數據系統採樣速率太慢--設定速率應是每峯大於10點; ④檢測器時間常數過大--設定時間常數爲感興趣第一峯半寬的10%; ⑤流動相粘度過高--增加柱溫,採用低粘度流動相; ⑥檢測池體積過大--用小體積池,卸下熱交換器; ⑦保留時間過長--等度洗脫時增加強溶劑含量，也可用梯度洗脫; ⑧柱外體積過大--將連接管徑和連接管長度降至最小; ⑨樣品過載--進小濃度小體積樣品。

 19.除了流速外，還有哪些因素能引起壓力改變? 改變流動相組成和溫度;改變柱長、柱內徑和填料粒度;柱突然阻塞壓力升高(正常情況下其它條件不變柱壓都是逐漸升高的)。

 20.什麼是強溶劑、弱溶劑? 改變流動相的組成或溶劑溶劑強度就可以改變峯容量因子和保留時間。

在一定條件下，減少保留時間或縮短分析時間的溶劑爲強溶劑，增加保留時間或延長分析時間的溶劑爲弱溶劑。

 21.怎樣才會使峯位發生重排? 在分析多組分樣品時，僅改變流動相的強度(組成百分比)而不改變其組成，一般僅僅改變所有組分的保留時間，不會發生峯位的重排。

 下列條件改變可能發生峯位重排： 流動相中換了強溶劑;pH值的改變;柱填料的改變;柱溫的改變;流動相的組成改變(如，加入離子對試劑三乙基胺等)。

 22.除了在線脫氣，常用的實驗室脫氣方式還有哪些? 加熱回流脫氣，脫氣效果最佳，但無法保持;氦脫氣，此方法脫氣效果佳，能除去百分之九十以上的空氣，但氦氣價格太貴，所以用的不多;真空脫氣，效果僅次於氦脫氣，但脫氣過程中容易造成樣品溶液揮發損失;超聲脫氣，只能脫去約百分之三十的空氣，但，在實驗室中最常用。

目前還是儘量爭取用在線脫氣，方便且效果好。

 23.評價一個色譜柱的最基本指標有那些? 評介一根色譜柱的基本指標是：塔板數、峯不對稱因子、柱壓降、適用範圍和鍵合相濃度以及峯容量。

 24.什麼是時間常數? 時間常數實際上是響應時間的設定，起著過濾噪音的作用。

時間常數太小(太快)可能增加短噪音，時間常數太大(太慢)可能出寬峯、拖尾峯。

 25.爲什麼在實驗過程中有時會出現倒峯? 所用的流動相在檢測波長下有吸收，而進在此波長下沒有吸收或吸收低於流動相的溶液，在流動相中會出現洞穴，通過柱後出現倒峯。

 26.爲何會出現「胖」峯和平頭峯?怎樣避免? 用比流動相強度大的大體積樣品進樣，通常會損害色譜圖的質量，而出現「胖」峯和平頭峯。

應遵循下列規則選用溶劑溶解樣品： a.最好用流動相溶解樣品進樣; b.用大體積弱溶劑溶解樣品，如，反相色譜中用水溶解樣品進樣，主要缺點是每次進樣後在色譜圖的開頭出現大的負峯，有時還波及到樣品峯; c.需要時用強溶劑溶解進樣。

 27.什麼是次級保留效應? 在良好的色譜分離中，樣品分子是以單一的保留過程被保留，如在反相色譜中，溶質與柱填料的非極性烷基鏈發生疏水性相互作用，但，在以矽膠爲基質的填料中，有些樣品組分能與矽醇基團相互作用，脫附的過程很慢，使峯嚴重拖尾，這就是次保留過程。

對付次保留效應最有效的方法就是選用封尾更好色譜柱或加入流動相改良劑(也叫掃尾劑)。

 28.前延峯的發生及處理? 因柱溫問題很易引起前延峯，有些樣品在常溫下分離可見前延峯，提高溫度後前延峯的現象消失。

在離子對色譜中，前延峯的另一個原因是用非流動相作樣品溶劑。

因此在離子對色譜中要求僅用流動相溶解樣品，而且進樣量不要太大，否則會導致前延峯或其它問題。

在rp-HPLC中樣品溶液的強度大於流動相引起前延峯。

增加流動相的強度，減少樣品溶液的強度，在離子對色譜中增加離子強度，可以克服前延峯的效應。

此外使用流動相溶解樣品是解決的最簡單實用的方法。

 29.峯變寬的原因? a.在使用過程中柱本身退化，逐漸降低柱效; b.柱外峯寬效應。

一根很好的專用柱用於另一液相色譜系統引起塔板數降低，說明新系統有很大的柱外峯寬效應; c.化學效應，多數是流動相和固定相相互作用所致，改變流動相可使寬峯有所改善。

 30.柱平衡慢的常見原因有哪些? 柱平衡慢的常見原因是，組分在舊的或新的流動相中對柱吸附強，或者，在新的流動相中濃度小甚至爲零： a.流動相含有胺改良劑; b.流動相含有離子對試劑;矽膠柱;流動相中有四氫呋喃。

可考慮採用專用柱用於特殊的方法，不用時將柱折下來，注滿適當的溶劑或流動相，密封保管，不再作其它的分析。

 31.用內標法實驗時對內標物的要求有哪些? a.內標物的結構或理化性質應與被分析組分相似或相近; b.內標物的保留值應稍大於或小於被分析物的保留，不能相差過大; c.內標物的峯要與所有被分析物的峯有良好的分離度(r大於1.5)，不能讓內標物成了干擾物; d.無結構相似的內標物，可用保留相近的內標物; e.儀器對分析物的響應與內標基本一致，出峯面積大小不能相差懸殊。

 32.管子切割與安裝注意事項? a.管子的斷面必須垂直，否則，將會產生死體積而引起色譜峯峯形擴展。

 b.確保管子內表面不被損傷，如果損傷，可能會發生管路堵塞。

 c.將管子完全插入開口端，直至其與開口端的末端相碰爲止。

否則，將會產生死體積而引起色譜峯峯形擴展。

 d.不要過分擰緊螺帽，以防損壞螺紋。

 33.什麼是HPLC的「無限直徑效應」? 在HPLC分析中由於使用了高效微粒固定相及高壓流動相，樣品以柱塞式注入色譜柱後，因柱的阻力大，樣品分子在柱中的分子擴散很小，直至它從色譜柱流出也未與色譜柱內壁接觸，因而引起的色譜峯形擴展很小，能保持高柱效。

 34.如何評價一台檢測器? a.噪聲： 通常噪聲是指由儀器的電氣元件、溫度波動、電壓的線性脈衝以及其他非溶質作用產生的高頻噪聲和基線的無規則波動; b.基線飄移： 漂移是基線的一種向上或向下的緩慢移動，可在較長時間(0.5~1h)內觀察到。

它可掩蔽噪聲和小峯。

漂移與整個液相色譜系統有關，而不僅是由檢測器引起的; c.靈敏度(最小檢出濃度或最小檢出量)： 在一個特定分離工作中，檢測器是否有足夠的靈敏度是十分重要的。

當比較檢測器時，常使用敏感度這一性能指標。

敏感度即指信號與噪聲的比值(信噪比)等於2時，在單位時間內進入檢測器的溶質的濃度或質量。

 d.線性範圍： 在進行定量分析時，希望檢測器有寬的線性範圍，以便在一次分析中可同時對主要組分和痕量組分同時進行檢測; e.檢測器的池體積： 它應小於最早流出的死時間色譜峯的洗脫體積的1/10，否則會產生嚴重的柱外譜帶擴展。

 35.如何簡單判斷比例閥是否內漏? 設定泵使用一個單獨通路(a)，打開purge閥，流速5mL/min，提起其他溶劑瓶內的溶劑過濾頭直至離開液面，觀察這些通路(b、c、d)內的溶劑是否隨著流動，正常時均不應流動。

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其中有一些問題可以通過改變設備參數得到解決;而其他的問題必須通過修改操作程序來解決。

對於色譜柱和流動相的正確選擇是得到好的色譜圖的關鍵。

　　2、進樣過多 　　a、減少進樣量 　　3、記錄儀連接不正確 　　a、正確連接記錄儀 　　S、高效液相色譜HPLC保留時間漂移的故障排除 　　保留時間不重現有兩種不同的情況：即保留時間漂移和保留時間波動。

高效液相色譜基線及其影響因素 但該模式的雜質檢測能力一般且方法運行時間比較長，不適合於多組分或基質複雜樣品的分析；梯度洗脫模式下，基線隨流動相組成的變化而不斷變化，基線噪音比較大，但其具有明顯縮短分析時間以及增加雜質的檢出能力(梯度洗脫時，色譜峯被梯度變化的流動相縱向壓縮，從而其峯寬減小，峯高增加)的特點，使其日益成爲最爲常見的液相色譜操作方式。

液相色譜柱損耗率高?五大維護關鍵問題必看! 常見色譜柱連接的問題主要有兩種，安裝色譜柱時管線伸出接頭長度過長，使得螺紋擰入較淺，會導緻密封性不好而漏液，進一步引起基線漂移或響應降低；反之，會在管線前段出現死體積，引起峯形展寬，靈敏度降低。

4）當基線和壓力平穩後測試，判斷是否充分平衡以連續進樣結果的重現為準。

若不夠可延長流動相的平衡時間。

關於色譜柱相關的100個問題! 可能柱子裡會有氣泡進去，但之後多用流動相衝沖，看到基線穩定，就沒問題了。

用色譜柱的保存液低流速長時間沖洗，然後再檢測一下柱效，看柱子是否恢復，液相最好設置一下最低壓限，這樣就不怕流動相走光而會損傷色譜柱。

「基線」這些問題,別說你沒遇到過 色譜百問百答,掌握這些你就成高級工程師了 可能柱子裡會有氣泡進去，但之後多用流動相衝沖，看到基線穩定，就沒問題了。

用色譜柱的保存液低流速長時間沖洗，然後再檢測一下柱效，看柱子是否恢復，液相最好設置一下最低壓限，這樣就不怕流動相走光而會損傷色譜柱。

氣相色譜48個常見問題及注意事項匯總 3、基線：在色譜操作條件下，沒有被測組分通過鑑定器時，記錄器所記錄的檢測器噪聲隨時間變化圖線稱爲基線。

4、峯高與半峯寬：由色譜峯的濃度極大點向時間座標引垂線與基線相交點間的高度稱爲峯高，一般以h表示。

色譜峯高一半處的寬爲半峯寬，一般以x１／２表示。

【解讀】35個氣相色譜常見問題及注意事項大匯總(上中下三篇) 本篇，我們就氣相色譜中常見的問題進行分析解讀。

凡是以氣相作爲流動相的色譜技術，通稱爲氣相色譜。

一般可按以下幾方面分類：1、按固定相聚集態分類：(1)氣固色譜：固定相是固體吸附劑，(2)氣液色譜：固定相是塗在擔體表面的液體。

液相色譜出現基線噪音怎麼辦?如何減小和消除呢? 流動相脫氣越好，基線就會越好。

如今最常用的脫氣方式是在線脫氣機，但是有的時候脫氣並不徹底。

所以當有基線噪音問題時，可以考慮採取多種脫氣方式。

前面1-3點講的都是內在原因造成的基線噪音或者波動。

如果你前面的原因都找過了，問題還沒有解決，就得考慮一下是不是流動相裡面有雜質了。

a. 最強大液相色譜詞彙中英文對照 chromatographicpeak　　色譜峯區域寬度peakwidth　　色譜富集過樣samtinjectionofchromatography　　色譜工作站chromatographicworkingstation　　色譜圖chromatogram　　色譜儀chromatograph 高效液相色譜儀性能的測試方法 重複測量三次，記錄色譜峯面積，取算術平均值，按式(4-7)計算殘留量。

4.2.4最小進樣時間在色譜數據工作站上設定分析方法，編輯序列，進樣量設爲20uL，選擇不洗針模式，點擊運行序列，同時用秒表計時，至完成進樣，色譜工作站開始採集數據爲止，記錄此過程的時間爲最小進樣時間。

秒懂這35個問題的人,在搞氣相的里能排top20%了 4、峯高與半峯寬：由色譜峯的濃度極大點向時間座標引垂線與基線相交點間的高度稱爲峯高，一般以h表示。

色譜峯高一半處的寬爲半峯寬，一般以x１／２表示。

5、峯面積：流出曲線（色譜峯）與基線構成之面積稱峯面積，用Ａ表示。

6、死時間、保留時間：從進樣到惰性氣體峯出現極大值的時間稱爲死時間，以td表示。

高效液相色譜儀出廠檢驗的操作規程 3.3靜態基線漂移及靜態短期基線噪聲3.3.1要求靜態基線漂移應不大於5×10-4AU/h；靜態短期基線噪聲應不大於3×10-5AU。

3.3.2設備色譜數據工作站一台3.3.3試驗程序檢測器波長爲254nm，檢測器爲空池（充滿空氣），響應時間（T90)不大於1.0s。

開機預熱後，記錄基線1h，取1h內平行包絡線的中心線的起點與終點的差值爲檢測器基線漂移。

如何延長液相色譜柱的使用壽命 2、色譜儀器的操作每次開機使用分析儀器時，泵啓動太快，流速和柱壓的瞬間升高，柱牀受到衝擊，引起紊亂，產生空隙，影響色譜柱的使用壽命。

因此，在操作實驗開始時，應當將流速和柱壓逐漸增加。

三、使用後的清洗與保存柱子使用一段時間後，總會有一些雜質累積在柱內，保留值較弱的物質，一般能快速從色譜柱沖洗出來，不產生干擾；中等保留強度的雜質能被緩慢沖洗出來，但對分析產生一定的干擾；強保留雜質通常聚集在柱頭或色譜柱中，難以被洗脫，甚至可能與填料發生相互作用，形成新的僞固定相，改變色譜柱的分離性能 液相色譜的定性方法EWG1990儀器學習網 儘管液相色譜法包括多種模式，但無論採用何種模式，對樣品進行定性及定量分析皆基於通過檢測器得到的圖信息。

液相色譜過程中影響溶質遷移的因素較多，同一組分在不同色譜條件下的保留值可能相差很大。

即便在相同的操作條件下，同一組分在不同色譜柱上的保留也可能有很大差別。

在同根色譜柱上的分離，有時甚至會因爲流動相組成的改變而出現出峯次序顛倒的現象。

色譜分析知識匯總 、理論1、氣相色譜的流出曲線（1）基線  僅有流動相（無試樣）通過檢測器時，檢測到的信號爲基線。

-液色譜在通常操作條件下有良好的對稱峯；⑷壽命長。

液體進樣器：不同規格的專用注射器，填充柱色譜常用10μL；毛細管色譜常用1μL。

氣化室：將液體試樣瞬間氣化的裝置；惰性，無催化作用。

6、填充柱、毛細管柱的比較毛細管柱具有較高的分離效率，表現爲峯形尖而窄，柱效高，可以將填充柱分離不開的兩個峯完全分離開。

最全解密氣相色譜FID:結構特點、常見故障及排除、實用檢查方式!新手速學!老司機速藏! 微量有機組分被載氣帶入檢測器以後，在氫火焰的作用下離子化。

產生的離子在發射極和收集極的外電場作用下定向運動形成微電流。

有機物在氫火焰中離子化效率極低，估計每50萬個碳原子僅產生一對離子。

離子化產生的離子數目，在一定範圍內與單位時間進入檢測器的被測組分的質量成正比。

液相色譜儀常用檢測器之蒸發光散射檢測器 液相色譜儀常用檢測器之蒸發光散射檢測器蒸發光散射檢測器液相色譜儀常用檢測器之蒸發光散射檢測器，首先被高壓氣流霧化，形成的小液滴進入蒸發室(漂移管)，流動相及低沸點的組分被蒸發，剩下高沸點組分的小液滴進入檢測池，光束穿過檢測池時被散射，散射光被檢測元件接收形成電信號，電信號通過放大電路、模數轉換電路、計算機成爲色譜工作站的數位訊號——色譜圖。

液相色譜柱:除了固定相,你還會分A和B嗎? 昨天在公司羣，新來的美眉同事拋出一個問題：「親們，誰知道什麼是A類矽膠色譜柱呀？說到液相色譜柱，相信大部分童鞋都知道按C18、C8等不同固定相進行區分，金屬雜質含量高的矽膠，其中的金屬雜質會與鰲合溶質絡合，從而引起不對稱峯和拖尾峯，甚至化合物完全被保留，不能洗脫出。